De invloed van biotransformatie op hop

Gist bezit de geweldige kracht om het ene molecuul in een ander te transformeren: biotransformatie. Biotransformatie, eenvoudig gedefinieerd, vindt plaats wanneer een levend organisme reageert op of inwerkt op een molecuul en het transformeert of opsplitst in een andere vorm. Deze transformatie kan heel subtiel zijn of magischer, wat resulteert in de expansie of zelfs herschikking van de individuele atomen van een molecuul in een nieuwe configuratie.

Over biotransformatie hoor je tegenwoordig steeds vaker, maar het is helemaal niets nieuws. Het is wat gist doet met al haar substraten. Het is wat onze cellen doen met dingen die we binnenkrijgen. Zo consumeert ons lichaam alcohol en zet het om in een meer in water oplosbare vorm - acetaldehyde - zodat we het kunnen uitscheiden en niet sterven aan de giftigheid.

In bier zijn er vier hoofdcategorieën van biotransformatie die de afgelopen decennia veel aandacht hebben gekregen. Om de reikwijdte van dit verhaal beperkt te houden, ga ik niet in op de inherente productie van secundaire metabolieten. Voorbeelden hiervan zijn diacetyl, dimethyl sulfide en fruitige esters - die allemaal afkomstig zijn van grondstoffenmoleculen die door gist worden opgenomen en vervolgens worden uitgespuugd.

De vier categorieën van biotransformatie die de laatste tijd het meest worden beschouwd, zijn:

1. Glycosidische splitsing 
2. Terpenol-transformatiezuurconversie
3. Organische
4. Thiol-afgifte

1. Glycosidische afgifte van smaakstofverbindingen

In een octrooi van de bekende Amerikaanse brouwer Miller Brewing Company is een methode beschreven voor het bereiden van een vol-hop gearomatiseerde drank met een lage bitterheid. Het geheim van deze methode was de glycosidische afgifte van smaakstoffen via gistbehandeling van gebruikt hopmateriaal. Dit verbruikte hopmateriaal waar men het over had is het plantaardige materiaal dat overblijft bij hopolie-extractie. Daarna werd er meer bekend over het gebruik van biotransformatie van gist op hop om hopsmaak aan bier toe te voegen, met name aan lichter bier.

Glycosiden zijn chemisch gezien suikers en vertegenwoordigen een brede klasse van moleculen die worden beschouwd als smaakvoorlopers of als -potentieel. Glycosiden zijn opgebouwd uit een suiker (Glycon) en een niet-suiker (Aglycon). Deze glycosiden zijn oplosbaar in water en door de aanwezigheid van een suikergroep (meestal β-D-glucose) niet-vluchtig. Glycosiden kunnen gehydrolyseerd (gesplitst) worden tot vrije aglyconen (meestal organische alcoholen of terpeenalcoholen) met behulp van een zuur en/of enzymen. Hydrolyse is de splitsing van een chemische verbinding onder opname van water. Bij deze splitsing ontstaan er dus twee nieuwe moleculen. Hydrolyse is niet hetzelfde als hydratatie. Bij hydratatie blijft de verbinding bestaan en worden de moleculen omgeven door watermoleculen.

Gist kan glycosiden hydrolyseren door enzymen in hun omgeving of op een substraat uit te scheiden. Interessant is dus dat er tijdens de hydrolyse van glycosiden smaak vrijkomt. Omdat de glycosiden oplosbaar zijn in water, zijn ze oplosbaar in wort en ze overleven ook nog het kookproces, waarna gist haar magie onthult tijdens de vergisting. Eerder onderzoek bij Miller Brewing Co. meldde al dat hop plantaardig materiaal bestaat uit 20-25% smaakglycosiden die bijdragen aan een matige hopsmaak, zachte bitterheid en verbeterde drinkbaarheid. Men heeft toen ook geleerd dat het merendeel van hopglycosiden uit drie categorieën bestaat: eenvoudige organische alcoholen, terpeen alcoholen en carbonylverbindingen. Sindsdien is er een overvloed aan sensorisch belangrijke glycosiden van monoterpeenalcoholen als linalool, terpineol en geraniol in hop geïdentificeerd.

Inzicht hebben in het glycosidepotentieel van een hopsoort kan dus belangrijk zijn omdat het een brouwer kan helpen het smaakpotentieel beter te begrijpen door de aanwezigheid van actieve gist tijdens vergisting en dry hopping. Helaas hebben niet alle gisten hetzelfde biotransformatieve vermogen. Onderzoekers in België onderzochten Saccharomyces en Brettanomyces brouwersgisten op hydrolyse-activiteit en met name de glycosidisch gebonden vluchtige verbindingen. Hoewel slechts enkele Saccharomyces- stammen een vermogen vertoonden om glycosiden af ​​te geven, niet-Saccharomyces- stammen zoals Brettanomyces custersii bezitten (geïsoleerd van Lambic) een hoge exo-β-glucanase-activiteit. Omdat er toch altijd wat te onderzoeken valt heeft men vervolgens gekeken naar de glycosidische afgifte van specifieke hopcultivars. Onderzoekers hebben specifiek gekeken naar Amerikaanse hopcultivars met een grote impact: Citra®, Simcoe®, Centennial en Cascade. Ook specifieke Duitse en Japanse variëteiten werden onder de loep genomen. Glycosidische hydrolyse kan aan het einde van de vergisting actiever zijn wanneer gisten onder voedingsstress staan ​​en glycosiden die er bier van maken, enzymatisch in uw mond kunnen hydrolyseren. Het toevoegen van hop of het plantaardige deel van hop aan wort en bier kan dus leiden tot een toename van een hoppige smaak. De impact van dit potentieel hangt grotendeels af van de hopvariëteit en uiteindelijk de gist, gisttype, enzymatisch vermogen, gistgezondheid en contacttijd van gist en hop.

2. Transformatie van terpenolen en terpenoïde esters

Terpenen zijn simpele koolwaterstoffen, ze bestaan uit koolstof- en waterstofatomen. Er zijn echter ook functionele verbindingen met andere stoffen zoals alcohol. Deze afgeleide groep heet terpenolen. Deze twee termen worden vaak door elkaar gebruikt. Terpenen zijn een grote en diverse klasse van organische stoffen die door planten worden geproduceerd en vaak worden gekenmerkt door een zeer intens aroma. Essentiële hopolie is rijk aan terpenen en, zoals we zojuist hebben besproken, zitten ze ​​ook in verbruikte hop of het plantaardige deel van hop als glycosiden. In de essentiële hopoliën bestaan ​​terpenen in hun vrije vorm of als glycosiden en/of worden ze verbonden met andere moleculen zoals aminozuren. Uit onderzoek is gebleken dat terpenolen (zoals linalool) grotendeels verantwoordelijk waren voor de hoppige smaak in bier. Hopvariëteiten die rijk zijn aan linalool zouden daarom worden aanbevolen om bier een hoppig karakter te geven. Het probleem ligt echter in het feit dat linalool in zijn vrije vorm vluchtig is en tijdens het koken als het ware verdampt. Dit is waar biotransformatie komt aanvliegen in zijn rode cape om het bier te redden.

Naast linalool zijn er een handvol monoterpenen, oftewel terpenolen, die impactcomponenten zijn voor een hoppige smaak: geraniol, citronellol, nerol en alfa-terpineol. Linalool, geraniol en citronellol dragen elk bij aan het bloemige-/citrusaroma in bier door late hoptoevoegingen. Er zijn andere terpenen zoals myrceen en caryofylleen die een sterk hoppig karakter aanduiden, maar deze terpenolen hebben een speciale verbinding met elkaar via een biotransformatieve route door de interactie met gist.

In deze route openbaart geraniol zich als een zeer belangrijke intermediaire terpenol, omdat het kan worden omgezet in β-citronellol (citrus), maar ook in linalool (lavendel) en nerol (citroengras). β-citronellol wordt niet vaak aangetroffen in hop en is typisch afwezig in wort, maar het is wel bekend dat de hoeveelheid β-citronellol tijdens de vergisting toeneemt. Overigens is aangetoond dat zowel vrije als gebonden geraniol (enzymatisch gesplitst door gist) verantwoordelijk is voor de toename van β-citronellol, linalool en nerol, en vervolgens alfa-terpineol. Naarmate deze verbindingen toenemen, werken ze samen om een hoppige citrus en bloemige smaak te onthullen. Zowel pils- als ale-gisten zijn in staat om terpenolen te biotransformeren.

Brouwers die op zoek zijn naar een hoppige citrussmaak, kunnen deze dus vinden in geraniolrijke hopsoorten. Geraniol is overigens meer cultivar-specifiek dan linalool en men heeft nog steeds geen volledig begrip van hoeveel glycosidisch-gebonden geraniol er in plantaardige hopstoffen voorkomt. Noord-Amerikaanse variëteiten en in Noord-Amerika geteelde Europese variëteiten bevatten vaak veel geraniol (Mosaic®, Bravo, Chinook, Citra®, Amarillo® zijn enkele goede voorbeelden). Europese variëteiten zoals Saaz bevatten doorgaans minder vrije geraniol. Duitse variëteiten zoals Comet, Hallertau Blanc, Polaris en Summit hebben een hoog potentieel voor glycosidisch-gebonden geraniol.

We begrijpen onderhand dat gist verantwoordelijk is voor het creëren van fruitige en bloemige esters tijdens de vergisting. Terwijl de overheersende manier van de productie van esters afhankelijk is van het aminozuurmetabolisme (denk aan isoamylacetaat welke verantwoordelijk is voor een lekkere banaankick), metaboliseren gisten vrije aglyconen tot acetaatesters zoals linaloolacetaat, citronellylacetaat en geranylacetaat. Gist kan deze esters verder hydrolyseren in hun subeenheden - zuren en terpeenalcoholen. Gist kan geranylesters tijdens de vergisting tot geraniol hydrolyseren en bijvoorbeeld Cascade heeft de neiging om veel geranylesters te bevatten die alleen vrijkomen door het biotransformatieve karakter van gist.

Dit brengt ons bij het volgende onderwerp: de gistactiviteit op organische- en vetzuren.

3. Biotransformatie van organische zuren naar esters om de biersmaak te verbeteren

Nu even kijken naar de impact van hop-afgeleide (vertakte) vetzuren op een fruitige biersmaak en het brouwen met oude hop om extreem fruitige en esterige smaken te krijgen. Oude hop in combinatie met Brettanomyces is een handelsmerk van Belgisch zuurbier/lambiek. Het schijnt dat Orval een bloemiger karakter krijgt naarmate het ouder wordt. De smaken kunnen van gist afkomstig zijn uit biotransformatie maar kunnen ook verkregen zijn door veroudering omdat ethanol inwerkt op organische zuren om ze te veresteren. Wat we weten is dat vertakte vetzuren afkomstig zijn van mout en hop en ook worden geproduceerd uit aminozuren tijdens de vergisting. Tijdens de opslag van hop nemen vertakte ketenvetzuren toe naarmate de hop ouder wordt door de afbraak van de hopzuurzijketens in isovaleriaanzuur (kaasachtig), isoboterzuur (braaksel) en 2-methylboterzuur (rottend fruit). Tijdens de vergisting zet gist deze zuren om in een estervorm om fruitige esterverbindingen te produceren: ethylisobutyraat, ethylisovaleraat en ethyl 2-methylbutyraat. Ethylesters van hop-vetzuren met korte ketens (ethyl-3-methylbutanoaat, ethyl-4-methylpentanoaat) worden bijvoorbeeld in verband gebracht met het citruskarakter van Saaz-hop. Hoewel er meer onderzoek nodig is om dit volledig te begrijpen, lijkt het erop dat er zowel wetenschappelijk als anekdotisch bewijs bestaat dat de verestering van organische zuren en de afbraak van esters door gist leidt tot een verhoogde fruitige, hoppige smaak in bier.

4. Vrijgave van gebonden thiolen

Thiol is een scheikundige term die ons vertelt dat een molecuul zwavel bevat. Zwavel komt veel voor tijdens de vergisting en hoewel veel zwavelverbindingen goed bekend zijn in bier - dimethylsulfide (maïs), mercaptan (afval), H₂S (lucifer) - hebben de polyfunctionele thiolen andere chemische groepen gebonden zoals een alkylacetaat, alcohol of andere carbonyl. Ze zijn echter heel bijzonder; ze zijn 'exotisch'. Deze soorten thiolen zijn extreem krachtig, zelfs bij hele kleine  concentraties. De jacht op de smaak van citrusachtige oorsprong in hop heeft onderzoekers naar deze thiolen gebracht. Thiolen komen veel voor in wijndruiven en zijn verantwoordelijk voor aroma's zoals Sauvignon Blanc, mango, papaja, citrus en andere tropische tonen. Amerikaanse, Nieuw-Zeelandse en veel nieuwe hopsoorten vertonen deze gewilde citrusachtige smaken in grotere hoeveelheden. Veredelingsinspanningen richten zich daarom ook begrijpelijkerwijs op het bestuderen van thiolen. Thiolen kunnen al dan niet prettig zijn en hoe aangenaam ze zijn, hangt af van de lengte en structuur van het molecuul. Wanneer de thiol 3-4 koolstofatomen lang is, heeft hij de neiging om minder aangename smaken te geven als gegrild vlees, bouillon, ui, plastic of champignons. Maar wanneer de thiol 5-8 koolstofatomen heeft, vertoont hij de neiging om meer exotisch fruit, passievrucht, citroen, grapefruit en citrusachtige smaken te vertonen.

Er zijn 41 polyfunctionele thiolen geïdentificeerd onder vijf hopcultivars: Tomahawk®, Nelson Sauvin, Nugget, Cascade en Saaz. Elke variëteit vertoonde verschillende impactthiolen in verschillende hoeveelheden. Tomahawk® heeft thiolen van citrus, bloemen, grapefruit en zwarte bes, terwijl Nugget beperkt lijkt tot citroen. Cascade en Nelson Sauvin zitten daar ergens tussenin.

Tegenwoordig weten we dat thiolen zowel in vrije als gebonden vorm voorkomen (in cysteïne en gluatathion), en dat de hoeveelheid thiolen in bier afhangt van het feit of een bepaalde gist wel goed werkt met een bepaalde hop om meer gebonden vormen vrij te maken tijdens de vergisting en het dry hoppen. Sorachi Ace bevat bijvoorbeeld veel cysteïne gebonden 3-suflnaylhexan-1-ol, maar niet zo hoog in de vrije vorm. Wat dit voor de brouwer betekent, is dat hij, om meer grapefruit / rabarber / passievrucht uit een hop als Sorachi Ace te halen, moet experimenteren met gist. Om de citrus / citroen- en grapefruittonen in Citra® te verhogen, moeten de geconjugeerde glutathion-verbindingen worden vrijgegeven. De Duitse variëteit Polaris heeft ook een grote potentie voor grapefruit, passievrucht en rabarber. Hoewel er nog zoveel onbekenden zijn, variëren thiolen in concentratie per hopvariëteit en per groeiregio en klimaat en zijn ze gevoelig voor landbouwbeheerpraktijken (zoals de toepassing van pesticiden die koper bevatten).

Bron

Biotransformation, dr. Pattie Aron, Brew Your Own Magazine